二维（2D）蛋白质薄膜可用于改变表面性质，主要使用在于生物材料、光刻、光学和电子学领域。然而，要以简便、低成本、绿色和高效的方法制备出可扩展的均质且坚固的蛋白质薄膜并不是特别容易。进一步的挑战包括在薄膜中封装和释放功能构件而不使其失活，以及保持或提高用于形成薄膜的蛋白质的生物活性。

  在此，陕西师范大学杨鹏教授课题组详细的介绍了通过常见合成蛋白质的淀粉样蛋白聚集来制备具有用户定义特征和结构的大型 2D 蛋白质薄膜的过程。经过控制二硫键断裂的位置，这些薄膜可在米级尺度上合成，具有高界面粘附性、高功能扩展性和可调功能特性。例如，可以保留甚至增强参与薄膜形成的蛋白质的天然抗菌、生物矿化和防污活性，还能够最终靠在薄膜表面物理混合或化学接枝更多的功能块来扩展薄膜的特性。使用浸泡、转移、水凝胶冲压和喷涂四种可供选择的涂层技术，可在约 3 小时内制备出二维蛋白质薄膜。相关成果以“Synthesis and functionalization of scalable and versatile 2D protein films via amyloid-like aggregation”为题发表在《Nature Protocols》上，第一作者为刘永春 ，苗舒婷和任浩为共同第一作者。

  1.天然球状蛋白质的淀粉样聚集是利用内部亲水键和外部疏水键来展开蛋白质结构，使其聚集成低聚物，然后将它们寡聚为β片结构，在溶液界面形成二维蛋白质薄膜。

  2.制备二维蛋白质薄膜的其他方法有流延、真空过滤和界面收集。使用淀粉样聚集法的优点包括使用易用性、生物相容性好、灵活性高和功能化程度高。

  作者详细的介绍了通过淀粉样蛋白样聚集体制备 2D 蛋白质膜所需的步骤，该聚集体的灵感来自蛋白质淀粉样蛋白原纤维的形成（图 1）。蛋白质天然结构中的稳定二硫键首先被还原剂破坏，导致蛋白质展开并暴露其疏水结构域。然后，这些未折叠的蛋白质聚集形成具有界面活性的低聚物，并最终在气-液或固-液界面组装，产生具有高浓度β片结构的二维蛋白质膜。任何影响蛋白质展开和聚集的因素都会影响薄膜的形成过程。因此，在实验中，作者应该要依据不同的目的从以下几个方面优化实验方案

  1.蛋白质类型的选择。并非所有蛋白质都能通过淀粉样聚集形成蛋白质膜。只要蛋白质具备三个关键要素--极易形成淀粉样纤维的区段、丰富的α-螺旋结构和固定α-螺旋的分子内S-S键，就能通过淀粉样聚集形成二维蛋白质膜。

  2.蛋白质的浓度。蛋白质浓度对薄膜的物理结构有很大影响。随着蛋白质浓度的增加，薄膜厚度增加，孔径变大。

  3.还原剂的类型。由于不同还原剂的还原能力不同，还原二硫键的还原途径和还原量也不同。

  1.浸渍法：将目标基底置于反应溶液中，在与溶液接触的表明产生蛋白质二维薄膜。这种方法适用于复杂结构，如管道内部或三维印刷产品。

  2.转移法：将独立薄膜从气液界面转移到目标基底上。蛋白质二维薄膜在溶液表面组装，形成独立薄膜。将基底浸入水中，提起并穿过水面，将干净的薄膜转移到基底表面。这种方法非常适合于覆盖具有网状结构的物体。、

  3.水凝胶印花：使用水凝胶印花将薄膜接触式印在基底上。水凝胶是这一工艺的理想材料，因为水凝胶含有大量水分，不会附着在薄膜朝水的一面。水凝胶的形状是预先确定的，因此能在目标表明产生具有相同形状的薄膜。这种方法非常适合于涂覆对水敏感的材料。

  4.喷涂法：在调整反应条件以延缓大颗粒聚集后，将反应溶液喷涂到基底上。反应 10 分钟后，用大量水冲洗蛋白质，在基底上形成二维蛋白质膜。这种方法非常适合于难以移动的物体。

  在该方案中，二维蛋白质薄膜是通过在气液或固液界面上的淀粉样聚集制备的。反应过程可分为三个步骤：蛋白质解折、低聚物聚集和在界面富集形成薄膜（图 1）。蛋白质的解折是由蛋白质中的二硫键断裂引发的。每种还原剂与蛋白质中二硫键的相互作用都不完全一样。例如，对二硫键的拉曼光谱分析表明，TCEP 能在几分钟内分解蛋白质中的大部分二硫键（图 3a），而 Sn 2+ 不仅能分解二硫键，还能与半胱氨酸配位形成特殊结构。有必要注意一下的是，二硫键的断裂位置与溶菌酶的活性位点有相当大的距离。因此，即使在薄膜形成后，溶菌酶的活性仍能保持。因此，被半胱氨酸还原的二维溶菌酶膜被视为一种生物活性膜。虽然在成膜过程中使用半胱氨酸可能没办法有效保留其他蛋白质的活性，但使用化学反应选择性地避开蛋白质的活性位点的想法可能仍然有助于用别的类型的蛋白质生成薄膜。这些抑制剂通过不同的机制破坏二硫键，但它们都能使蛋白质展开并暴露疏水结构域，ANS（图 3b）和色氨酸荧光（图 3c）的变化证明了这一点。由于疏水微区的暴露，未折叠的蛋白质进一步聚集成寡聚体（图 3e、f），然后，这些寡聚体在固液或气液界面进行淀粉样组装，形成二维蛋白质膜。

  无论使用哪种二硫键断裂剂，二维蛋白质薄膜看起来都是致密光滑的，由直径通常为几十纳米的低聚物组成（图 4a-d）。得益于出色的均匀性，涂覆在不同基底上的薄膜显示出相似的水接触角（图 4e）。此外，用 TCEP 或半胱氨酸制备的薄膜显示出超过 90% 的优异光学透明度（图 4f）。在二级结构方面（图 4g-i），所有这些二维蛋白质薄膜都主要由富含 β 片层的淀粉样结构组成。通过一系列分析二维蛋白质薄膜的拉曼光谱、傅立叶变换红外光谱和 XPS 光谱，能确定其化学基团组成（图 5）。

  由于这些功能基团的暴露，蛋白质薄膜与其底层基底之间可能会形成多重结合位点，其中涉及金属-S、氢键、疏水相互作用和静电相互作用（图 6a,b）。这些相互作用将支持蛋白质薄膜与各种不一样的材料之间形成较为强大的界面粘附力。此外，薄膜中含有大量的 β-片，因此产生的之字形排列结构将逐渐增强粘附强度。薄膜中的淀粉样结构还能明显提高其内聚力（图 6c-e）。β 片也赋予了蛋白质薄膜良好的机械性能。二维溶菌酶薄膜的弹性模量约为 3 GPa，刚度为 1.1-2.4 μN/nm。这种薄膜具有强大的附着力和稳定的机械性能，因此能对其进行化学改性，而无需考虑危险条件的影响，应用场景范围十分广泛。

  物理混合可用于以简单高效的方式将小分子、多肽、蛋白质和胶体等功能块结合到二维蛋白膜中。具体方法是将功能块与蛋白质和还原剂（如半胱氨酸）混合（图 7a）。罗丹明 B（RB）等荧光染料可以很容易地被捕获到蛋白质膜中，从而使二维蛋白质膜具有荧光特性（图 7b）。正如 FITC 标记的多肽（图 7c）和 FITC 标记的胰岛素（图 7d）的 CLSM 所显示的，蛋白质膜可以封装各种功能性生物大分子。除胰岛素外，BSA 和 HRP 等其他蛋白质也可以轻松又有效地固定在蛋白膜中，同时保留其 90% 以上的生物活性（图 7e）。有必要注意一下的是，这种简单温和的封装方法不会影响功能分子的生物活性。此外，碲化镉量子点（CdTe QDs，直径 2 nm）或金纳米粒子（AuNPs，直径 10 nm）也可以装载到蛋白质薄膜中，荧光显微镜和 TEM 显示，纳米粒子的分布基本均匀（图 7f、g）。这对于超灵敏生物分子检测、癌细胞杀伤和其他应用来说是非常理想的。

  化学接枝是扩展蛋白质薄膜功能的另一种方法，例如将 PEG 接枝到二维溶菌酶薄膜上（图 8a）。MALDI-TOF MS 图谱分析证实，每个溶菌酶分子都成功接枝了一个 PEG 分子（图 8b）。在溶菌酶-PEG 溶液中加入 TCEP 会形成乳状液，TEM 分析证实了这一点（图 8c），液滴大小约为 17 nm（图 8d）。TCEP 对二硫键的还原导致 ThT 的荧光强度增强（图 8e），表明淀粉样蛋白含量增加，疏水性微域也暴露出来，ANS 荧光增加就是证明（图 8f）。CD 光谱显示，溶菌酶-PEG 乳液中的α-螺旋成分过渡到了β-片状成分（图 8g）。与原生溶菌酶不同，溶菌酶-PEG 乳液能立即粘附在基底上，形成一层水接触角约为 60°的涂层，低于原生溶菌酶膜的水接触角（约 70°）。原子力显微镜成像显示涂层由纳米级低聚物组成（图 8i）。薄膜在可见光范围内也显示出良好的透明度（图 8j）。PEG 分子为溶菌酶-PEG 提供了出色的防污能力，可有很大效果预防生物膜的形成。结合蛋白膜固有的生物矿化能力，溶菌酶-PEG 膜涂层可有效封闭暴露的牙本质小管，治疗牙本质过敏症。

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